Componentes y funciones de la matriz de los biofilms bacterianos

Una de las mayores preocupaciones en materia de higiene en la industria alimentaria es la formación de biofilms bacterianos. Los biofilms son agrupaciones de microorganismos que se acumulan en una interfase sólido-líquido y que se encuentran rodeados de una matriz mucilaginosa[1]. La matriz del biofilm es el material extracelular, producido en su mayoría por los propios microorganismos, en el que se encuentran embebidas las células del biofilm y consiste en un conglomerado de diferentes tipos de biopolímeros – conocidos como Sustancias Poliméricas Extracelulares (EPS) – que forman el soporte para la estructura tridimensional del biofilm. La formación de biofilms permite a las células una forma de vida completamente diferente del estado planctónico, protegiéndolas de entornos adversos y facilitando su supervivencia.

La formación de biofilms sobre las superficies sigue un proceso secuencial representado en la Figura 1, y que se inicia con la adhesión de células a la superficie. Esto da lugar a la formación de microcolonias, que induce a las células agrupadas a cambios fenotípicos mediante los cuales dichas células se adaptan al nuevo entorno y comienzan a producir EPS para formar la matriz del biofilm y hacerlo crecer. El biofilm maduro presenta una estructura que se extiende perpendicularmente a la superficie, muchas veces con forma de champiñón, y que presenta canales por los que puede circular el agua.

Tabla_1_Biofilm_g

Figura 1. Etapas de la  formación de un biofilm maduro sobre una superficie.

La matriz del biofilm retiene a las células y las mantiene próximas entre sí, permitiendo un elevado grado de interacción, incluida la comunicación intercelular y la formación de microconsorcios sinergísticos. La matriz protege además a los organismos frente a la desecación, oxidantes, biocidas, algunos antibióticos y cationes metálicos, radiación ultravioleta y defensas inmunes. Sin embargo, las células del biofilm no están completamente inmovilizadas, sino que pueden moverse en el interior del biofilm y desprenderse del mismo.

Existe una gran variedad de EPS que pueden formar la matriz de biofilms, dependiendo de los microorganismos presentes, las fuerzas de cizalla experimentadas durante su formación, la temperatura y la disponibilidad de nutrientes. En general, los componentes mayoritarios de la matriz del biofilm son agua, polisacáridos,  proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y otros biopolímeros. La Figura 2 representa de forma esquemática la variedad de EPS que conforman la matriz del biofilm y cómo éstas se distribuyen entre las células del mismo.

Tabla_2-biofilm

Figura 2. Representación de la distribución de los componentes mayoritarios de la matriz del biofilm (polisacáridos, proteínas y ADN) entre las células que habitan el biofilm [2].

La estructura del biofilm está influenciada por las EPS que conforman su matriz, así como por otros muchos factores, como las condiciones hidrodinámicas, concentración de nutrientes, movilidad bacteriana y comunicación intercelular y los iones metálicos que puedan existir en el medio.

A continuación se describen algunos de los componentes mayoritarios de la matriz del biofilm:

Exopolisacáridos

Los polisacáridos constituyen una fracción mayoritaria de la matriz extracelular, y aparecen de forma ubicua en biofilms formados en distintos entornos: agua salada, agua dulce, suelos, infecciones en humanos, cultivos de laboratorio, etc. La mayoría son moléculas largas, lineales o ramificadas, con masa molecular alrededor de 106 D[3] y consisten en una mezcla de azúcares neutros y cargados, de forma que son heteropolisacáridos. Pueden contener además sustituyentes orgánicos o inorgánicos que afectan de forma significativa a sus propiedades físicas y biológicas. Por ejemplo, uno de los exopolisacáridos más habituales es el alginato, constituido por los ácidos D-manúrico y L-gulurónico y producido en biofilms de Pseudomona aeruginosa, uno de los modelos de biofilm más estudiados[4].

Los exopolisacáridos cumplen diversas funciones esenciales para la formación de biofilms, generalmente asociadas a su adhesión a superficies y al mantenimiento de la integridad estructural. Su naturaleza química puede variar en función de los microorganismos que los producen, aunque los exopolisacáridos encontrados en la matriz del biofilm no necesariamente reflejan la distribución microbiana del biofilm, debido a que en biofilms de especies mixtas pueden alojarse células incapaces de producir exopolisacáridos[5].

Proteínas extracelulares

Las proteínas presentes en la matriz extracelular poseen funciones que permiten el crecimiento del biofilm y la supervivencia de las células alojadas mediante el acceso a nutrientes o la regulación de la integridad y la estabilidad del biofilm.

La matriz del biofilm contiene diversas enzimas extracelulares, generalmente asociadas a exopolisacáridos, muchas de las cuales están implicadas en la degradación de biopolímeros. La presencia de enzimas que degradan componentes de la matrix extracelular convierte a dicha matriz en un sistema digestivo externo que degrada biopolímeros a productos de baja masa molecular que pueden ser asimilados y utilizados como fuentes de energía y carbono. Por ejemplo, la degradación de los exopolisacáridos se debe fundamentalmente a hidrolasas y liasas. Estas enzimas pueden actuar sobre EPS producidas por la misma bacteria que produce el enzima o sobre EPS procedente de otras especies. Asimismo, la degradación de EPS estructurales cumple una función importante en el desarrollo del biofilm, ya que permite la dispersión de  células sésiles de biofilms, lo que permite la formación de nuevos biofilms. Esta dispersión ocurre como respuesta a cambios ambientales tales como escasez de nutrientes o disponibilidad súbita de nutrientes.

Adicionalmente, otras enzimas pueden incluso degradar las superficies que alojan el biofilm, como es el caso de enzimas redox que contribuyen a la corrosión microbiana[6].

Las proteínas no enzimáticas de la matriz, tales como las asociadas a las paredes celulares o las lectinas (proteínas de unión de carbohidratos), están implicadas en la formación y estabilización de la red de polisacáridos de la matriz y constituyen un enlace entre la superficie bacteriana y las EPS extracelulares. Estas proteínas promueven la formación de biofilms en diversas especies bacterianas y juegan papeles como la adhesión a superficies inanimadas y células huésped[7].

Finalmente, los apéndices proteicos, tales como pili, fimbrias y flagelos, pueden también actuar como elementos estructurales mediante su interacción con otras EPS de la matriz del biofilm.

ADN extracelular

El ADN extracelular (eADN) constituye una parte integral de la matriz del biofilm y de su modo de vida[8]. Por ejemplo, se ha comprobado que el eADN es un componente mayoritario en la matriz de biofilms de P. aeruginosa, donde actúa como conector intercelular, y de hecho la presencia de DNAasa inhibe la formación de dichos biofilms[9]. En biofilms de otras especies, eADN actúa como adhesivo o incluso como antimicrobiano, causando lisis celular mediante la quelación de cationes que estabilizan lipopolisacáridos y la membrana externa bacteriana.

Tensioactivos y lípidos

A diferencia de polisacáridos, proteínas y ADN, que son moléculas hidrofílicas, existen en la matriz del biofilm otras EPS con propiedades hidrofóbicas. Este carácter hidrofóbico ha sido asociado a sustituyentes metilo y acetilo en polisacáridos o a lípidos, que son cruciales para la adherencia de las bacterias a superficies hidrófobas.

Además, otras EPS con capacidad tensioactiva, como surfactina, viscosina y emulsan, pueden dispersar sustancias hidrofóbicas y facilitar su disponibilidad. Los biotensioactivos han sido identificados como factores que promueven la formación inicial de microcolonias, facilitando la migración de bacterias asociadas a la superficie y la formación de estructuras con forma de champiñón, previniendo la colonización de canales y contribuyendo a la dispersión del biofilm.

Agua

El componente mayoritario de la matriz del biofilm es agua. La matriz exopolimérica proporciona un entorno altamente hidratado que pierde agua más lentamente que su entorno y por lo tanto protege a las células del biofilm frente a fluctuaciones en el potencial de agua. Las bacterias responden de forma activa a la desecación produciendo EPS[10]. Además, la matriz exopolimérica puede actuar como un filtro molecular, reteniendo cationes, aniones, componentes apolares y partículas en la fase acuosa. Las EPS contienen regiones apolares, grupos con potencial para la formación de puentes de hidrógeno, grupos aniónicos (en ácidos urónicos y proteínas) y grupos catiónicos (en amino azúcares).

EPS y las propiedades mecánicas del biofilm

En general, los biofilms muestran propiedades viscoelásticas. Pueden experimentar tanto respuestas elásticas reversibles como deformaciones irreversibles, dependiendo en las fuerzas que actúan sobre la matriz exopolimérica.  Este hecho sugiere que existen puntos de unión fluctuantes entre componentes EPS que permanecen unidos mediante interacciones físico químicas débiles como puentes de hidrógeno, fuerzas de van der Waals e interacciones electrostáticas (ver Figura 2). El entrecruzamiento de biopolímeros contribuye a la estabilidad de la matriz[11]. Asimismo, la interacción de iones inorgánicos multivalentes con EPS puede influir de forma significativa en las propiedades mecánicas de los biofilms. Por ejemplo, la presencia de Ca2+ incrementa la estabilidad mecánica de los biofilms de Pseudomonas aeruginosa, debido al entrecruzamiento de moléculas polianiónicas de alginato[9].

En conclusión, la matriz del biofilm bacteriano es un entorno extremadamente complejo que posibilita a las células alojadas una forma de vida completamente diferente a la del estado planctónico. Las sustancias exopoliméricas (EPS) son esenciales para la formación de biofilms y su variedad proporciona diversas funciones que posibilitan la supervivencia de las células en el biofilm frente a agresiones externas y su expansión. La complejidad de la matriz del biofilm y el nivel de protección que esta forma de vida proporciona a los microorganismos hacen que su formación suponga un importante riesgo para la seguridad de los alimentos y que el control de biofilms requiera de la aplicación de procedimientos de higiene específicos y el uso de herramientas especializadas.

Bibliografía

[1] Chmielewski R.A.N., Frank J.F. (2003) Biofilm formation and control in food processing facilities. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety 2, 22-32.

[2] Flemming H.C., Wingender J. (2010) The biofilm matrix. Nature Reviews 8, 623-633.

[3] Wingender J., Strathmann M., Rode A., Leis A., Flemming H.C. (2001) Isolation and biochemical characterization of extracellular polymeric substances from Pseudomonas aeruginosa. Methods in Enzymology 336, 302-314.

[4] Ryder C., Byrd M., Wozniak D.J. (2007) Role of exopolysaccharides in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Current Opinion in Microbiology 10, 644-648.

[5] Sillman L., Sutherland I.W., Jonse M.V. (1999) The role of exopolysaccharides in dual species biofilm development. Journal of Applied Microbiology 85, S13-S18.

[6] Busalmen J.P., Vázquez M., de Sánchez S.R. (2002) New evidences on the catalase mechanism of microbial corrosion. Electrochimica Acta 47, 1857-1865.

[7] Lasa I., Penadés J.R. (2006) Bap: a family of surface proteins involved in biofilm formation. Research in Microbiology 157, 99-107.

[8] Wingender J., Neu T., Flemming H.C. (1999) En Microbial Extracellular Polymeric Substances 1-19 (Springer, Heidelberg).

[9] Whitchurch C.B., Tolker-Nielsen T., Ragas P.S., Mattick J.S. (2002) Extracellular DNA required for bacterial biofilm formation. Science 295, 1487.

[10] Roberson E.B., Firestone M.K. (1992) Relationship between dessication and exopolysaccharide production in a soil Pseudomonas sp.  Applied Environmental Microbiology 58, 1284-1291.

[11] Körstgens V., Flemming H.C., Wingender J., Borchard W. (2001) Influence of calcium ions on the mechanical properties of a model biofilm of mucoid Pseudomonas aeruginosa. Water Science and Technology 43, 49-57.

Sobre el Autor
Fernando Lorenzo
Fernando Lorenzo Director de Innovación y Calidad Doctor en Química por la Manchester Metropolitan University (2009), coordina los proyectos de I+D y el desarrollo de nuevos productos en Betelgeux. Es autor de varias publicaciones como el Libro: Listeria monocytogenes en industrias cárnicas.
It's only fair to share...Tweet about this on TwitterShare on LinkedInShare on FacebookShare on Google+Email this to someoneShare on Tumblr

Deja un comentario

Tu dirección de correo electrónico no será publicada. Los campos obligatorios están marcados con *